文章引用曲博士猪群健康管理公众号，通过问答的形式，和大家一起学习关于实验室荧光定量PCR的基本知识。
问题1：PT-PCR、qPCR、Real- time PCR、real-time PR-PCR有什么区别？ ⑴ RT-PCR是逆转录 PCR，是普通PCR的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行 DNA扩增。 ⑵ Real-time PCR和 qPCR是一样的，都是实时定量PCR，指的是PCR过程中每个循环都有数据的实时记录，因此可以对起始模板数量进行精确的分析。 ⑶ Real-time PCR和 RT-PCR看起来都可以缩写为RT-PCR，但是国际上普遍认为RT-PCR特指反转录PCR，而Real-time PCR一般缩写为 qPCR。 ⑷ Real-time RT-PCR（RT-qPCR）， 就是结合了荧光定量技术的反转录PCR：先从 RNA 反转录得到 cDNA（RT），然后再用 Real-time PCR进行定量分析（qPCR）。 问题2：什么是扩增曲线？ 扩增曲线是指PCR过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中实时荧光强度为纵坐标所做的曲线。 问题3：什么是基线（Baseline）？ 基线是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大。接近一条直线，这样的直线即是基线。 问题4：荧光域值（threshold）怎么设定？ 一般将 PCR反应前 15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR 3~15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在 PCR扩增的指数期。 一般来说，每台仪器在使用前都已经设置好了荧光阈值。 问题5：什么是CT值？ CT值表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小，反之亦然。 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标难曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数。纵坐标代表CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 问题6：什么样的扩增曲线是正常的？ 可以从以下4个方面评估： ⑴ 曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显，扩增曲线整体平行性好。 ⑵ 曲线指数期斜率与扩增效率成正比，斜率越大扩增效率越高。 ⑶ 标准的基线平直或略微下降，无明显的上扬趋势。 ⑷ 各管的扩增曲线平行性好，表明各反应管的扩增效率相近。 问题7：什么是熔解曲线？ 对PCR产物加热，随着温度的升高，双链扩增产物逐渐解链，DNA双链逐渐解链为单链，嵌入到双链中的荧光染料分子也会逐渐脱落下来，荧光信号强度逐渐下降。 在某段温度时，双链迅速而大量地解链，荧光信号强度骤然下降，在这段温度中，一半的双链解链的温度我们称为熔解温度（即Tm值）。 最终DNA双链完全解链为单链，荧光值下降为一个本底水平。这一整体过程中的荧光信号随温度变化的曲线就是熔解曲线，称为原始图谱。该图谱做负导数换算后得到熔解曲线的导数图谱，导数图谱会出现熔解峰，熔解峰对应的温度就是Tm值。 问题8：熔解曲线如何解读？ ⑴ 如果在80℃-90℃之间出现唯一主峰，说明荧光定量PCR完美； ⑵ 如果在80℃-90℃之间出现主峰，80℃以下出现杂峰，基本考虑引物二聚体，可尝试提高退火温度解决； ⑶ 如果在80℃-90℃之间出现主峰，温度上升又出现杂峰，基本上考虑有DNA污染，需要在实验初始阶段去除DNA。 问题9：如何绘制标准曲线？ 将标准品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值作为纵坐标，绘制标准曲线。 对未知样品进行定量时，根据未知样本的CT值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。标准曲线在绝对定量的时候非常重要。
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